LEBIH KENAL DENGAN SDS PAGE

Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) merupakan metode yang digunakan untuk mengetahui berat molekul dari suatu protein. Prinsip kerja dari SDS-PAGE adalah ketika protein dipisahkan oleh elektroforesis melalui matriks gel dan arus listrik diberikan, protein dengan molekul yang lebih kecil bermigrasi lebih cepat sedangkan molekul yang lebih besar akan tertahan akibat pergerakan yang lebih lambat. Pengaruh lain pada laju migrasi adalah berdasarkan struktur dan muatan proteinnya. SDS adalah deterjen dengan efek denaturasi protein yang kuat dan mengikat struktur protein. Dengan adanya SDS dan zat pereduksi yang membelah ikatan disulfide, protein terlihat menjadi rantai linier dengan muatan negatif sebanding dengan panjang rantai polipeptida.

Dalam pengerjaan SDS-PAGE terdapat 2 jenis gel yang penting yaitu separating gel dan stacking gel. Konsentrasi yang sering digunakan dalam pembuatan separating gel adalah 10%, 12,5% dan 15% sedangkan untuk stacking gel  adalah 4%. Jika sampel mempunyai berat molekul yang tinggi maka konsentrasi separating gel separating gel yang digunakan harus konsentrasi yang rendah, begitu pula sebaliknya. Komponen penyusun dari separating gel dan stacking gel  adalah ddH₂O, 1,5 M Tris pH 8,8, acrylamide, SDS, ammonium persulfate (APS) dan Tetramethylethylenediamine (TEMED). Akan tetapi yang menjadi sedikit berbeda adalah dalam pembuatan stacking gel menggunakan 0,5 M Tris pH 6,8.

Preparasi sampel dibutuhkan sebelum pengerjaan SDS-PAGE untuk mendenaturasi protein. Sampel dapat didenaturasi dengan cara melarutkannya ke SDS 10% kemudian sampel dilarutkan ke dalam sampel buffer (mengandung Tris-HCl, gliserol, SDS, merkaptoetanol, dan bromfenol biru) dan dipanaskan pada suhu 100⁰C selama 5 menit. Sampel dimasukkan ke dalam sumuran yang mengandung gel pemisah (separating gel) dan gel penahan (stacking gel). Kit protein digunakan sebagai protein marker dengan berat molekul 4.6-180 kDa. Elektroforesis dilakukan dengan dua kali proses menggunakan 30 volt selama 30 menit dan 100 volt selama 90 menit. Selanjutnya gel direndam dalam fixing buffer selama 30 menit dilanjutkan dengan perendaman dengan larutan pewarna (staining solution) untuk melihat pita protein. Larutan pewarna yang sering digunakan adalah Commasie Brilliant Blue dengan lama waktu perendaman selama 30 menit. Larutan peluntur (destaining solution) diberikan selanjutnya sampai terlihat jelas pita protein di permukaan gel. Berat molekul protein ditentukan dengan memasukkan jarak migrasi ke dalam persamaan regresi linier standard marker.

Penulis
Dwi Yuli Pujiastuti
Departemen Kelautan
Email: dwiyp@fpk.unair.ac.id